Die Hauptunterschied zwischen Umkehrphasen- und hydrophober Interaktionschromatographie besteht darin, dass die Umkehrphasenchromatographie (RPC) verwendet ein hydrophoberes Medium, was zu stärkeren Wechselwirkungen führt, während die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ein weniger hydrophobes Medium verwendet als das Medium bei der Umkehrphasenchromatographie.

Umkehrphasenchromatographie und hydrophobe Interaktionschromatographie sind zwei chromatographische Techniken, die von den Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Oberflächen eines Chromatographiemediums und den hydrophoben Flecken auf der Oberfläche von Biomolekülen abhängen.

Hydrophobe Interaktionschromatographie, HIC, Medien, Umkehrphasenchromatographie, RPC

Was ist Umkehrphasenchromatographie?

Umkehrphasenchromatographie (RPC) ist eine chromatographische Technik, die bei der Reinigung und Analyse von Biomolekülen wie Proteinen, Peptiden und Oligonukleotiden verwendet wird. Es liefert eine hochauflösende Trennung und ist ideal für das Peptid-Mapping und die Reinheitsprüfung. RPC wird häufiger beim abschließenden Polieren von Peptiden und Oligonukleotiden verwendet.

Als stationäre Phase können zwei Haupttypen hydrophober Medien verwendet werden: mit Kohlenstoffketten bedeckte Silicaperlen oder nackte hydrophobe Polymere. Eine Säule wird mit dem hydrophoben Medium in Form eines gepackten Betts gepackt, auf das die Probe aufgetragen wird. Ein Ionenpaarungsagens wie Trifluoressigsäure (TFA) kann der mobilen Phase zugesetzt werden, um die Bildung hydrophober Wechselwirkungen zu verstärken. Zu Beginn wird ein organischer Modifikator wie 5% Acetonitril verwendet und die Elution kann mit zunehmendem Acetonitril-% gestartet werden.

Abbildung 1: Theorie der Umkehrphasenchromatographie

Biomoleküle, die weniger hydrophob/polarer sind, eluieren zuerst, während die hydrophoberen Moleküle später eluieren. RPC ist die Chromatographietechnik mit der höchsten Auflösung.

Was ist hydrophobe Interaktionschromatographie?

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ist die andere Technik, die bei der Trennung von Biomolekülen basierend auf der Hydrophobie unter moderaten Bedingungen verwendet wird. Es ist eine ideale Technik zur Aufreinigung von Proteinen, wenn die Proben einer Ammoniumsulfatfällung in der anfänglichen Probenkonzentration und Aufreinigung unterzogen werden müssen. Der erhöhte Salzgehalt während der Ammoniumsulfatfällung erhöht die Wechselwirkung zwischen hydrophoben Komponenten.

Abbildung 2: Einfluss einer hohen Salzkonzentration auf hydrophobe Wechselwirkungen

Das hydrophobe Medium von HIC besteht aus einer inerten Matrix aus kugelförmigen Partikeln, die mit Liganden beschichtet sind, die Alkyl- oder Arylgruppen enthalten. Die hydrophoben Wechselwirkungen treten bei mäßig hohen Salzkonzentrationen (typischerweise 1–2 M Ammoniumsulfat oder 3 M NaCl) auf. Der Startpuffer gewährleistet die Bindung der interessierenden Proteine ​​an das Medium, während die Verunreinigungen weggespült werden. Der Elutionspuffer enthält eine geringe Salzkonzentration, wodurch die Wechselwirkung zwischen Proteinen und der stationären Phase abgeschwächt wird.

Ähnlichkeiten zwischen Umkehrphasenchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie

Unterschied zwischen Umkehrphasenchromatographie und hydrophober Interaktionschromatographie

Definition

Umkehrphasenchromatographie (RPC) bezieht sich auf die Trenntechnik mit der höchsten Auflösung, die auf der Hydrophobie der Moleküle in einer Mischung basiert, während sich die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) auf eine Art von Trenntechnik bezieht, die auf der Hydrophobie basiert, aber unter relativ milden Bedingungen arbeitet.

Hydrophobie

Der RPC arbeitet unter hydrophoberen Bedingungen, während der HIC unter relativ milden hydrophoben Bedingungen arbeitet.

Interaktionen

Die Umkehrphasenchromatographie führt zu stärkeren Wechselwirkungen zwischen Molekülen und der stationären Phase, die während der Elution durch einen organischen Modifikator umgekehrt werden müssen, während HIC zu mäßig hohen Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und den Molekülen führt.

Hydrophobe Medien

RPC verwendet entweder mit Kohlenstoffketten bedeckte Siliciumdioxidkügelchen oder nackte hydrophobe Polymere, während HIC eine inerte Matrix aus kugelförmigen Partikeln verwendet, die mit Liganden beschichtet sind, die Alkyl- oder Arylgruppen enthalten.

Startpuffer

Der Startpuffer in RPC verwendet Trifluoressigsäure (TFA), während der Startpuffer von HIC mäßig hohe Salzkonzentrationen verwendet.

Elution

Der erhöhte Prozentsatz an Acetonitril beginnt die Elution in RPC, während die abnehmende Salzkonzentration die Elution in HIC beginnt.

Auflösung

Die Umkehrphasenchromatographie ist die chromatographische Technik mit der höchsten Auflösung, während die Auflösung von HIC im Vergleich zu RPC gering ist.

Anwendungen

RPC wird bei der Trennung von Proteinen, Peptiden und Oligonukleotiden verwendet, während HIC hauptsächlich bei der Reinigung von Proteinen verwendet wird.

Abschluss

Die Umkehrphasenchromatographie ist die Chromatographietechnik mit der höchsten Auflösung, die unter stark hydrophoben Bedingungen arbeitet. HIC arbeitet jedoch unter mäßigen hydrophoben Bedingungen. RPC und HIC sind die zwei Arten von Trenntechniken, die auf der Hydrophobie basieren. Der Hauptunterschied zwischen RPC und HIC ist der Grad der Hydrophobie, der bei jeder Technik verwendet wird.

Referenz:

1. Hydrophobe Wechselwirkung und Umkehrphasenchromatographie: Prinzipien und Methoden. GE Healthcare, 2006. Hier erhältlich

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Reverse Phase Gradient Elution Schematic“ von Nategm – Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia 2. „Hicsalt“ von Daliak bei English Wikibooks – Von en.wikibooks auf Commons übertragen. (Public Domain) über Commons Wikimedia