Hauptunterschied – PCR vs. RT-PCR

PCR und RT-PCR sind zwei wichtige Techniken in der Molekularbiologie. Die PCR wurde in den 1980er Jahren von Kary Mullis entwickelt. Es ist in der Lage, die Kopienzahl eines bestimmten Gens exponentiell zu erhöhen, was den Nachweis dieses bestimmten DNA-Fragments erleichtert. Taq Polymerase ist das am häufigsten in PCR-Systemen verwendete Enzym. Es ist ein thermostabiles Enzym. Bei der RT-PCR folgt auf die reverse Transkription eine PCR. Das Enzym Reverse Transkriptase ist an der Synthese von komplementärer DNA aus RNA beteiligt. Die Hauptunterschied zwischen PCR und RT-PCR ist das PCR verwendet doppelsträngige DNA als Matrize, während RT-PCR RNA als Matrize verwendet.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist PCR – Definition, Prozess, Anwendung 2. Was ist RT-PCR? – Definition, Eigenschaften, Anwendung 3. Was ist der Unterschied zwischen PCR und RT-PCR? – Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: PCR, RT-PCR, Polymerase-Kettenreaktion, Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion, DNA-Template, DNA-Polymerase, Denaturierung, Annealing, Primer-Extension

Was ist PCR?

PCR (Polymerase Kettenreaktion) ist eine relativ einfache, aber revolutionäre Methode. Die PCR nutzt die Fähigkeit des Enzyms DNA-Polymerase, neue DNA-Stränge komplementär zum angebotenen Matrizenstrang zu synthetisieren. Die PCR ist eine unverzichtbare Technik, die sowohl in klinischen als auch in Forschungslabors zur funktionellen Analyse von Genen, Diagnose und Überwachung von Erbkrankheiten, DNA-Klonierung, Sequenzierung und Amplifikation alter DNA verwendet wird. DNA-Matrize, Nukleotide, Primer und DNA-Polymerase sind die vier Hauptkomponenten der PCR. Die DNA-Vorlage ist in der Regel eine doppelsträngige DNA mit der zu amplifizierenden Zielsequenz. Taq DNA-Polymerase welches aus Thermus aquatics isoliert wird, wird üblicherweise in der PCR verwendet. Die Pfu-DNA-Polymerase ist eine andere Art von DNA-Polymerase mit hoher Wiedergabetreue. Sowohl Taq- als auch Pfu-Polymerasen sind hitzebeständig. Die von den DNA-Polymerasen hinzugefügten Nukleotide sind Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Da DNA-Polymerase nur ein neues Nukleotid an ein 3'-Ende eines bereits bestehenden DNA-Strangs anfügen kann, ist ein Oligonukleotid-Primer für die Initiierung der DNA-Synthese erforderlich. Das Erfordernis eines Primers bei der PCR ermöglicht es, nur eine spezifische Region in der Matrize abzugrenzen. Die Zielsequenz wird von Vorwärts- und Rückwärtsprimern flankiert. Am Ende einer PCR werden in Milliardenhöhe neue Kopien, sogenannte Amplikons, einer bestimmten DNA-Sequenz angesammelt. Die Komponenten der PCR sollten so optimiert werden, dass die PCR-Leistung verbessert und gleichzeitig Fehler minimiert werden.

PCR ist ein automatisierter Prozess, der von Thermocyclern durchgeführt wird, die zwischen verschiedenen Temperaturen umschalten können. Die PCR ist ein dreistufiger Prozess.

1. Denaturierung – Das doppelsträngige DNA-Templat wird durch Erhitzen auf 94-95 °C in zwei Einzelstränge getrennt.
2. Glühen – Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden an die komplementären Sequenzen im Template. Die Temperatur dieses Schrittes hängt von der Schmelztemperatur der Primerkombination ab.
3. Primerverlängerung – Das DNA-Polymerase-Enzym verlängert jeden der Primer an seinem 3’-Ende, indem es dem wachsenden Strang komplementäre Basen hinzufügt. Als Temperatur im Verlängerungsschritt wird die optimale Temperatur der Taq-Polymerase von 72 °C verwendet. Der Zeitpunkt der Verlängerung hängt von der Anzahl der Basenpaare im Matrizenstrang ab.

Die drei Schritte werden 28-35 Mal wiederholt.

Abbildung 1: Polymerase-Kettenreaktion

Die Produkte der PCR werden durch Agarosegelelektrophorese im Vergleich zu einer DNA-Leiter größenfraktioniert. Die Visualisierung der DNA auf einem Agarosegel erfolgt durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Beobachten unter UV. Die amplifizierten DNA-Banden unter UV in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel sind in Abbildung 2 dargestellt. Die DNA-Leiter ist ganz links in der Vertiefung dargestellt.

Abbildung 2: DNA-Banden

Was ist RT-PCR?

RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion) ist eine der empfindlichsten Techniken zum Nachweis von mRNA. RNA ist die geeignete Matrize, um Informationen entweder über die Genexpression eines normalen Gewebes oder die Genexpression eines infizierten Gewebes zu sammeln. Die Matrize für die RT-PCR kann entweder Gesamt-RNA oder virale bzw. bakterielle RNA sein. RNA wird durch das Enzym Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) revers transkribiert. Die optimale Temperatur der reversen Transkriptase beträgt 46 °C. Die cDNA wird in der PCR verwendet, um das Produkt zu erhalten. Schritte in der reversen Transkriptions-PCR sind in Abbildung 3 gezeigt.

Abbildung 3: RT-PCR

RT-PCR kann in zweistufigen oder einstufigen Reaktionen durchgeführt werden. Bei der zweistufigen Reaktion werden die reverse Transkription und die PCR in zwei getrennten Schritten durchgeführt. Bei der einstufigen RT-PCR folgt auf die reverse Transkription eine sequentielle PCR in einem einzelnen Röhrchen. Sowohl cDNA als auch das endgültige PCR-Produkt können zur Größenfraktionierung und Visualisierung auf einem Agarosegel laufen gelassen werden. Ein- und zweistufige RT-PCR sind in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4: Ein- und zweistufige RT-PCR

Unterschied zwischen PCR und RT-PCR

Definition

PCR: PCR ist eine Technik, die in der Molekularbiologie verwendet wird, um ein DNA-Segment zu amplifizieren, wodurch Millionen von Kopien einer DNA-Sequenz erzeugt werden.

RT-PCR: RT-PCR ist eine Variante der PCR, die zum Nachweis der Genexpression in der Molekularbiologie verwendet wird.

Schritte

PCR: Denaturierung, Annealing und Extension sind die drei Schritte der PCR.

RT-PCR: Bei der RT-PCR folgt auf die reverse Transkription eine PCR.

Vorlage

PCR: Als Matrize für die PCR dient ein doppelsträngiges DNA-Molekül.

RT-PCR: Als Matrize für die reverse Transkription dient ein einzelsträngiges RNA-Molekül. Als Matrize für die PCR dient ein einzelsträngiges DNA-Molekül.

Verwendete Enzyme

PCR: Als Enzym wird bei der PCR DNA-Polymerase verwendet.

RT-PCR: Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase werden als Enzyme in der RT-PCR verwendet.

Grundierungen

PCR: Bei der PCR werden Vorwärts- und Rückwärtsprimer verwendet.

RT-PCR: Für die reverse Transkription wird nur der Reverse-Primer verwendet und bei der PCR werden sowohl Vorwärts- als auch Reverse-Primer verwendet.

Empfindlichkeit

PCR: Die PCR ist eine sensitive Methode.

RT-PCR: RT-PCR ist sensitiver als PCR.

Anwendungen

PCR: Die PCR wird bei der funktionellen Analyse von Genen, der Diagnose und Überwachung von Erbkrankheiten, der DNA-Klonierung, der DNA-Sequenzierung und der Amplifikation alter DNA verwendet.

RT-PCR: RT-PCR wird beim Nachweis der Genexpression verwendet.

Abschluss

PCR und RT-PCR sind zwei der wichtigsten Techniken, die in der Molekularbiologie verwendet werden. Sowohl PCR als auch RT-PCR sind automatisierte Techniken, die in der Lage sind, die Kopienzahl einer Ziel-DNA-Sequenz, die durch die Vorwärts- und Rückwärtsprimer definiert wird, exponentiell zu erhöhen. Bei der PCR wird doppelsträngige DNA als Matrize verwendet. Durch PCR können DNA-Klonierung, DNA-Sequenzierung und funktionelle Analyse der Gene durchgeführt werden. Bei der RT-PCR kann die Genexpression in einem bestimmten Gewebe durch Amplifikation von RNA beobachtet werden. Der Hauptunterschied zwischen PCR und RT-PCR liegt in ihren in jeder Reaktion verwendeten Matrizen und ihren Anwendungen.

Referenz:

1. „Polymerase-Kettenreaktion (PCR).“ Nationales Zentrum für Biotechnologie-Informationen. U.S. National Library of Medicine, ohne Datum Netz. Hier verfügbar. 01. Juni 2017. 2. "Polymerase-Kettenreaktion (oder PCR)." Klonen und molekulare Analyse von Genen. N.S., N.D. Netz. Hier verfügbar. 1. Juni 2017. 3. Biolabs, Neuengland. „CDNA-Synthese & RT-PCR.“ CDNA-Synthese & RT-PCR | NEB. N.S., N.D. Netz. Hier verfügbar. 01. Juni 2017.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Polymerase-Kettenreaktion“ Von Enzoklop – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 2. „DNA-fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis.“ Von Rainis Venta – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 3. „Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion“ Von Jpark623 – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 4. „Ein-Schritt vs RT-PCR” Von Jpark623 – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia