Hauptunterschied – PCR vs. QPCR

PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und qPCR (quantitative PCR) sind zwei Techniken, die in der Biotechnologie verwendet werden, um DNA für verschiedene Zwecke zu amplifizieren. PCR ist eine relativ einfache Technik. qPCR ist auch bekannt als Echtzeit-PCR oder digitale PCR. Die Hauptunterschied zwischen PCR und qPCR ist das PCR ist eine qualitative Technik, während qPCR eine quantitative Technik ist. PCR ermöglicht das Lesen des Ergebnisses als „Anwesenheit oder Abwesenheit“. Bei der qPCR wird jedoch die in jedem Zyklus amplifizierte DNA-Menge quantifiziert. Wenn RNA in der PCR verwendet wird, wird die Technik als RT-PCR (Reverse Transkriptions-PCR) bezeichnet, und wenn RNA in der qPCR verwendet wird, wird die Technik als qRT-PC bezeichnet.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist PCR – Definition, Prozesse, Verwendungen 2. Was ist QPCR? – Definition, Prozesse, Verwendungen 3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen PCR und QPCR? – Überblick über die gemeinsamen Funktionen 4. Was ist der Unterschied zwischen PCR und QPCR? – Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: Agarose-Gelelektrophorese, Amplikons, DNA-Polymerase, Fluoreszenzfarbstoff, PCR, Sonden, qPCR, RT-qPCR

Was ist PCR?

PCR bezieht sich auf eine Technik in der Biotechnologie, die die Analyse einer kurzen DNA-Sequenz durch Amplifikation eines ausgewählten DNA-Segments ermöglicht. Es ist eine vergleichsweise empfindliche Methode, da für eine einzige Reaktion sehr kleine Volumina benötigt werden. Die Technik basiert auf der Fähigkeit der DNA-Polymerase, komplementär neue DNA-Stränge zu dem angebotenen Matrizenstrang zu synthetisieren. Das Reaktionsgemisch der PCR besteht aus DNA-Polymerase, DNA-Nukleotiden, Primern, der zu amplifizierenden DNA-Matrize und Magnesium. Die Amplifikation erfolgt in einem Thermocycler. DNA-Polymerase sollte hitzebeständig sein, da bei dieser Reaktion hohe Temperaturen verwendet werden. Die beiden Arten von DNA-Polymerasen, die bei der PCR verwendet werden, sind die Taq-DNA-Polymerase und die Pfu-DNA-Polymerase. Taq-DNA-Polymerase wird häufig in der PCR verwendet.

DNA-Polymerase benötigt einen bereits vorhandenen DNA-Strang am 3'-Ende, um einen neuen Strang zu synthetisieren. Daher wird dem Reaktionsgemisch ein Oligonukleotid-Primer zur Initiierung der DNA-Synthese zugesetzt. Das Erfordernis eines Primers bei der PCR erlaubt die Amplifikation nur einer spezifischen Region in der Matrize. Die Zielsequenz wird von Vorwärts- und Rückwärtsprimern flankiert. Am Ende einer PCR werden neue Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz, genannt Amplikons, werden in Milliardenhöhe angehäuft. Die Komponenten der PCR sollten so optimiert werden, dass die PCR-Leistung verbessert und gleichzeitig Fehler minimiert werden. Die Standard-PCR-Reaktion ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: PCR

Schritte der PCR

Die drei Schritte einer PCR werden im Folgenden beschrieben.

1. Denaturierung – Das doppelsträngige DNA-Templat wird durch Erhitzen auf 94-95 °C in zwei Einzelstränge getrennt.
2. Glühen – Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden an die komplementären Sequenzen im Template. Die Temperatur hängt von der Schmelztemperatur der Primerkombination ab.
3. Primerverlängerung – Das DNA-Polymerase-Enzym verlängert jeden Primer an seinem 3'-Ende, indem dem wachsenden Strang komplementäre Basen hinzugefügt werden. Die optimale Temperatur der Taq-Polymerase, d. h. 72 °C, wird als Temperatur im Verlängerungsschritt verwendet. Der Zeitpunkt der Verlängerung hängt von der Anzahl der Basenpaare im Matrizenstrang ab.

Die drei Schritte werden 28-35 Mal wiederholt. Agarosegelelektrophorese wird bei der Größenfraktionierung von PCR-Produkten verwendet. Das Produkt wird durch Ethidiumbromid gefärbt und wird unter UV beobachtet. Das PCR-Produkt oder die amplifizierte DNA kann bei der Klonierung, Sequenzierung oder Genotypisierung verwendet werden.

Was ist QPCR?

QPCR bezeichnet eine Technik in der Biotechnologie, die den Nachweis, die Charakterisierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren für verschiedene Anwendungen ermöglicht. Daher handelt es sich um eine Art quantitativer PCR. Als qPCR können sowohl DNA als auch RNA verwendet werden. Wenn RNA als Matrize verwendet wird, sollte sie zuerst in cDNA revers transkribiert werden. Daher ist diese Art der qPCR bekannt als RT-qPCR. Die traditionelle PCR wird für cDNA oder übliche DNA-Proben durchgeführt. Bei der qPCR werden jedoch Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, um das PCR-Produkt in jedem Schritt des PCR-Zyklus zu markieren. Dies ermöglicht die Sammlung von Daten im Verlauf der PCR und ermöglicht die Quantifizierung der Amplikons während der exponentiellen Phase der PCR. Der bei der qPCR hauptsächlich verwendete Farbstofftyp ist SYBR Green. Der Farbstoff bindet an die doppelsträngige DNA. Da die Fluoreszenz proportional zur Menge der amplifizierten DNA erhöht wird, kann die Quantifizierung in „Echtzeit“ erfolgen. Der Hauptnachteil der Verwendung des Farbstoffs besteht darin, dass er die Quantifizierung eines bestimmten Produkts in der Probe ermöglicht. Neben Farbstoffen können auch Sonden im Quantifizierungsprozess verwendet werden. TaqMan-Sonden sind eine der wichtigsten Arten von Oligonukleotid-Sonden, die in der qPCR verwendet werden, und der Prozess der Fluoreszenzemission ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: TaqMan-Sonde

Sonden können so gestaltet werden, dass sie mehrere PCR-Produkte in derselben Probe nachweisen. Die TaqMan-Sonde ist eine der wichtigsten Arten von Hydrolysesonden; der Einbau dieser Sonde in das PCR-Produkt legt das Fluorophor frei und emittiert die Fluoreszenz. Fluoreszierende Farbstoffe sind spezifischer für das PCR-Produkt. Daher werden sie in den meisten diagnostischen Assays verwendet, um das PCR-Produkt nachzuweisen.

Ähnlichkeiten zwischen PCR und QPCR

Unterschied zwischen PCR und QPCR

Definition

PCR: PCR ist eine Technik in der Biotechnologie, die die Analyse einer kurzen DNA-Sequenz durch Amplifikation eines ausgewählten DNA-Segments ermöglicht.

QPCR: QPCR ist eine Technik in der Biotechnologie, die den Nachweis, die Charakterisierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren für verschiedene Anwendungen ermöglicht.

Quantitativ qualitativ

PCR: PCR ist qualitative Technik.

QPCR: QPCR ist eine quantitative Technik.

Erkennung des Produkts

PCR: Das Produkt wird durch die Agarosegelelektrophorese in der PCR nachgewiesen.

QPCR: Das Produkt kann in jedem Amplifikationszyklus in qPCR nachgewiesen werden.

Datensammlung

PCR: Die Daten werden am Ende der Reaktion in der PCR gesammelt.

QPCR: Die Daten werden während der exponentiellen Phase der Reaktion in qPCR gesammelt.

Auflösung

PCR: PCR hat eine sehr schlechte Auflösung.

QPCR: QPCR hat eine sehr hohe Auflösung.

Farbstoffe

PCR: Die PCR verwendet Ethidiumbromid, um das Produkt während der PCR zu färben.

QPCR: QPCR verwendet fluoreszierende Farbstoffe, um das Produkt zu erkennen.

Zeit

PCR: Die PCR ist eine zeitaufwendigere Methode.

QPCR: QPCR ist weniger zeitaufwendig.

RNA

PCR: RT-PCR ist die Art der PCR, die RNA als Matrize verwendet.

QPCR: RT-qPCR ist die Art der qPCR, die RNA als Matrize verwendet.

Rolle

PCR: PCR wird verwendet, um das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter genomischer Fragmente nachzuweisen.

QPCR: QPCR wird verwendet, um ein bestimmtes Fragment in einer Probe zu quantifizieren.

Abschluss

PCR und qPCR sind zwei Arten von Techniken, die in der Biotechnologie verwendet werden, um DNA für verschiedene Zwecke zu amplifizieren. PCR ist die traditionelle Amplifikationsmethode, die verwendet wird, um das Vorhandensein oder Fehlen eines DNA-Fragments zu identifizieren. QPCR wird verwendet, um ein bestimmtes Fragment in einer Probe zu quantifizieren. Somit ist PCR eine qualitative Technik, während qPCR eine quantitative Technik ist. Dies ist der Hauptunterschied zwischen PCR und qPCR.

Referenz:

1. „QPCR vs. digitale PCR vs. traditionelle PCR.“ Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „PCR“ von Madprime – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia2. „Taqman“ von User:Braindamaged – Eigene Arbeit des ursprünglichen Uploaders (Public Domain) über Commons Wikimedia