Die Hauptunterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion besteht darin, dass der pH-Wert von Die DNA-Extraktion beträgt pH 8, während der pH-Wert der RNA-Extraktion pH 4,7 beträgt. DNA neigt dazu, bei saurem pH zu denaturieren und in die organische Phase überzugehen. Bei alkalischem pH unterliegt die RNA einer alkalischen Hydrolyse aufgrund des Vorhandenseins von 2′ OH im Ribosezucker.

DNA- und RNA-Extraktion sind die beiden Verfahren, die an der Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus Gewebezellen beteiligt sind. Beide Verfahren bestehen aus drei Schritten. DNA und RNA von guter Qualität spielen eine entscheidende Rolle in Molekularbiologie, Biotechnologie, Genomik und epidemiologischen Experimenten.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist DNA-Extraktion? – Definition, Vorgehensweise 2. Was ist RNA-Extraktion? – Definition, Vorgehensweise 3. Was sind die Ähnlichkeiten zwischen DNA- und RNA-Extraktion? – Überblick über die gemeinsamen Funktionen 4. Was ist der Unterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion? – Vergleich der wichtigsten Unterschiede

Schlüsselbegriffe: Zelllyse, Denaturierung von Proteinen, DNA-Extraktion, pH, Präzipitation, RNA-Extraktion

Was ist DNA-Extraktion?

DNA-Extraktion ist das Isolierungs- und Reinigungsverfahren von DNA. DNA kann aus Blut, gefrorenen Gewebeproben oder Paraffin-Gewebeblöcken isoliert werden. Die drei Schritte der DNA-Extraktion sind Zelllyse, DNA-Isolierung und Präzipitation. Während der Zelllyse brechen Zellmembranbarrieren wie die Zellmembran und die Membranen des Zellkerns auf, um DNA freizulegen. Der nächste Schritt ist die Entfernung von Membranlipiden aus der Probe. Schließlich beinhaltet die Präzipitation von DNA die Entfernung von DNA-assoziierten Proteinen durch Protease und die Entfernung von RNA durch RNase.

Abbildung 1: DNA-Extraktionsverfahren

Grundprotokolle der DNA-Extraktion

Unten gezeigt sind die grundlegenden Protokolle der DNA-Extraktion.

1. Zelllyse mit dem Zelllysepuffer zur Lyse von Zellmembranen

2. Lipide werden mit Detergenzien und Tensiden abgebaut

3. Proteinverdauung durch Zugabe von Protease

4. Verdau von RNA durch Zugabe von RNase

5. Abtrennung von Zelltrümmern, verdauten Proteinen, Lipiden und RNA durch Zugabe von konzentriertem Salz gefolgt von Zentrifugation

6. Ethanolfällung von DNA mit eiskaltem Ethanol oder Isopropanol. Die Ionenstärke von Natriumacetat kann zur Verbesserung der Fällung genutzt werden. Die ausgefällte DNA erscheint als Fäden in der endgültigen Lösung.

Abbildung 2: Extrahierte DNA

Die Phenol-Chloroform-Extraktion kann auch verwendet werden, um DNA von Proteinen zu trennen. Hier denaturiert Phenol die Proteine ​​in der Probe und die DNA verbleibt am Ende der Extraktion in der wässrigen Phase. Und in der organischen Phase finden Sie die denaturierten Proteine. Ein weiteres Verfahren zur Extraktion von DNA ist die Minisäulen-Reinigung. Hier hängt die Bindung von DNA in die Säule vom pH-Wert und der Salzkonzentration des Puffers ab.

Was ist RNA-Extraktion?

RNA-Extraktion bezieht sich auf den Prozess der Reinigung von RNA aus Proben. Die konventionelle Methode der RNA-Extraktion heißt Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion. Guanidiniumthiocyanat denaturiert Proteine. Darüber hinaus unterbricht es die Wasserstoffbrückenbindung von Wassermolekülen und dient als chaotropes Mittel. Bei der RNA-Extraktion wird ein spezielles Reagenz verwendet, das sogenannte Tri-Reagenz. Es enthält Guanidiniumthiocyanat, Phenol und Natriumacetat. Der Zweck der grundlegenden Schritte der RNA-Extraktion ist ähnlich wie bei der DNA-Extraktion. Das Protokoll für die RNA-Extraktion ist unten beschrieben.

1. Zellen werden mit eiskaltem PBS gewaschen, um die Osmolarität der Zellen aufrechtzuerhalten.

2. Aspirieren Sie die Zellen und homogenisieren Sie die Probe mit Tri-Reagenz.

3. Chloroform hinzufügen und schütteln.

4. Die Zentrifugation kann zu drei Schichten führen. Die oberste Schicht ist die wässrige Schicht, die klar ist. Die mittlere Schicht oder die Interphase enthält die ausgefällte DNA. Die untere Schicht ist die organische Schicht, die rosa ist.

5. Entfernen Sie die wässrige Schicht und fügen Sie Isopropanol hinzu. Die Zentrifugation kann zu einem Pellet führen.

6. Waschen Sie das Pellet mit 75 % Ethanol. Das Pellet an der Luft trocknen.

7. Lösen Sie das Pellet mit TE-Puffer oder Wasser auf.

Abbildung 3: Phenol-Chloroform-Extraktion von RNA

Die RNA-Extraktion wird im Allgemeinen bei einem pH-Wert unter 7 durchgeführt. Bei einem alkalischen pH-Wert wird RNA aufgrund des Vorhandenseins einer OH-Gruppe an der 2'-Position des Ribosezuckers eher durch alkalische Hydrolyse abgebaut. Außerdem neigt RNA dazu, bei saurem pH in der wässrigen Phase zu verbleiben. Andererseits neigt DNA dazu, bei saurem pH zu denaturieren und in die organische Phase überzugehen. Daher kann die DNA-Extraktion bei etwa pH 8 durchgeführt werden. DNA besteht aus Desoxyribose-Zucker und unterliegt keiner alkalischen Hydrolyse.

Ähnlichkeiten zwischen DNA- und RNA-Extraktion

Unterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion

Definition

DNA-Extraktion: Isolierungs- und Reinigungsverfahren von DNA

RNA-Extraktion: Verfahren zur Reinigung von RNA aus Proben

Art der extrahierten Nukleinsäure

DNA-Extraktion: DNA

RNA-Extraktion: RNA

pH

DNA-Extraktion: Fertig bei 8

RNA-Extraktion: Fertig bei 4.7

Schritte

DNA-Extraktion: Aufbrechen der Zellmembranen oder Zelllyse, Entfernen der Membranlipide und Ausfällen der DNA

RNA-Extraktion: Zelllyse, Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, Präparation mit Isopropanol

Verwendung von DEPC-behandeltem Wasser

DNA-Extraktion: Keiner

RNA-Extraktion: Alle Reagenzien werden mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt

Lagerung

DNA-Extraktion: DNA kann vorher extrahiert werden und wird in Chargen gespeichert

RNA-Extraktion: Die RNA-Extraktion erfolgt kurz vor den nachgelagerten Verfahren

Langzeitlagerung

DNA-Extraktion: Bei -20 °C

RNA-Extraktion: Bei -80 °C

Abschluss

Die DNA-Extraktion wird bei pH 8 durchgeführt. DNA neigt dazu, in die organische Phase überzugehen, wenn sie bei saurem pH denaturiert. Die RNA-Extraktion wird jedoch bei niedrigem pH durchgeführt, um einen Abbau durch alkalische Hydrolyse zu verhindern. Der grundlegende Zweck der Schritte der DNA- und RNA-Extraktion ist ähnlich. Der Hauptunterschied zwischen DNA- und RNA-Extraktion sind die pH-Bedingungen, die bei jeder Extraktionsart verwendet werden.

Referenz:

1. „Die Grundlagen der DNA-Extraktion.“ Alaska BioPREP Virtuelles Lehrbuch, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, hier erhältlich2. "RNA-Isolierung und Reverse Transcription Protocol: Zellen in Kultur." abcam, hier erhältlich

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Abbildung 17 01 02“ von CNX OpenStax – (CC BY 4.0) über Commons Wikimedia 2. „DNA-Extraktion“ von Joo Nath – Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia 3. „PhOH-CHCl3-Extraktion“ Von Squidonius (Vortrag) – Eigene Arbeit (Originaltext: selbst erstellt) (Public Domain) über Commons Wikimedia