Primer sind eine wesentliche Komponente bei der Amplifikation von DNA sowohl in vivo als auch in vitro. In vivo benötigt das Enzym DNA-Polymerase einen Primer für die Initiierung der DNA-Replikation. In vitro werden Primer meistens zur Initiierung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet. Einige andere Techniken einschließlich Sequenzierung, Klonierung, ortsgerichtete Mutagenese usw. erfordern Primer. Daher wird das Design von Primern für In-vitro-Techniken recht einfach, aber für Molekularbiologen ein herausfordernder Prozess. Daher werden in diesem Artikel die Grundregeln für das Primer-Design sowohl für die PCR als auch für die Sequenzierung diskutiert.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist eine Grundierung? – Definition, Typen, Rolle 2. Wie funktionieren Primer in einer PCR? – Merkmale der DNA, Prozess der PCR 3. Wie man Primer für die PCR herstellt – Grundregeln für das Design von PCR-Primern 4. Wie man einen Sequenzierungs-Primer entwirft – Merkmale von Sequenzierungsprimern

Schlüsselbegriffe: DNA-Synthese, Vorwärtsprimer, Länge, Schmelztemperatur, PCR, Rückwärtsprimer, Sequenzierungsprimer

Was ist ein Primer?

Ein Primer ist ein kurzer DNA- oder RNA-Strang, der als Ausgangspunkt für die DNA-Synthese dient. Die Enzyme, die die DNA-Replikation katalysieren, sind in der Lage, Nukleotide an ein vorhandenes 3'-Ende anzufügen. Daher legt der Primer die Grundlage für die DNA-Synthese, indem er als Primer dient. RNA-Primer werden innerhalb der Zelle zur Initiierung der DNA-Replikation durch DNA-Polymerase verwendet. Allerdings synthetisch DNA-Primer kann für die Amplifikation von DNA verwendet werden, hauptsächlich durch PCR und andere Techniken. Bei der PCR werden zwei Arten von Primern verwendet, die als Vorwärts- und Rückwärtsprimer bekannt sind. Während der PCR können Millionen von Kopien des gewünschten DNA-Fragments hergestellt werden, indem diese bestimmte DNA-Sequenz in der genomischen DNA durch Vorwärts- und Rückwärtsprimer flankiert wird. Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine bestimmte DNA-Sequenz flankieren, sind in 1 gezeigt.

Abbildung 1: Vorwärts- und Rückwärtsprimer

Wie funktionieren Primer in der PCR?

DNA ist ein Molekül mit zwei Strängen, die zusammengehalten werden. Das Basenpaarmuster ist in beiden Strängen jeweils komplementär. Die beiden Stränge werden durch die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Stickstoffbasen zusammengehalten. Darüber hinaus hat jeder Strang seine eigene Ausrichtung. Ein Strang hat eine Direktionalität von 5' bis 3′, während der andere eine Direktionalität von 3′ bis 5′ hat. Daher sind die beiden Stränge antiparallel. Der Strang mit 5′- bis 3′-Richtung wird als Sense-Strang bezeichnet, während der Strang mit 3′- bis 5′-Richtung als Antisense-Strang bezeichnet wird. Jeweils zwei Stränge sollten während der PCR einzeln synthetisiert werden.

Die drei Schritte der PCR sind Denaturierung, Annealing und Elongation. Bei der Denaturierung werden die beiden DNA-Stränge durch Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen durch Erhitzen auf 95 °C getrennt. Der Vorwärtsprimer bindet an den Sense-Strang, während der Rückwärtsprimer an den Antisense-Strang bindet. Das Annealing von Primern erfolgt, wenn die Temperatur von 95 °C auf 50-60 °C sinkt. Somit können beide Stränge gleichzeitig mit Hilfe der Taq-Polymerase synthetisiert werden. Die Amplifikation sowohl der Sense- als auch der Antisense-Stränge erfolgt in 5'-zu 3'-Richtung. Da die PCR eine exponentielle Reaktion ist, werden die drei Schritte in 25-35 Zyklen wiederholt. Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtsprimer werden in jedem Zyklus verwendet, um etwa 2. zu produzieren³⁵ Kopien des gewünschten DNA-Fragments. Die Rolle der Primer bei der PCR ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: PCR

So stellen Sie Primer für die PCR her

Um ein bestimmtes DNA-Fragment im Genom zu amplifizieren, sollte dieses bestimmte DNA-Fragment sowohl von Vorwärts- als auch Rückwärtsprimern flankiert werden. Daher sollten beide Primer komplementär zu den Sequenzen sein, die das DNA-Fragment flankieren. Im Folgenden werden die grundlegenden Richtlinien für das erfolgreiche Design von PCR-Primern beschrieben.

1. Die Richtung sowohl des Vorwärts- als auch des Rückwärtsprimers sollte 5′ bis 3′ betragen.
2. Die Länge jedes Primers sollte zwischen 18 und 25 Nukleotiden lang sein.
3. Der GC-Gehalt von Primern liegt zwischen 40 und 60 % und das Vorhandensein eines C oder G am 3’-Ende des Primers kann die Bindung fördern.
4. Die Schmelztemperatur und Tm (die Temperatur, bei der die Hälfte des Primers an die Matrize angelagert ist) des Primerpaars sollten ähnlich sein und über 60 °C liegen. Die maximale Differenz sollte 5 °C betragen.
5. Das 3'-Ende des Primers sollte genau mit der Template-DNA übereinstimmen.
6. In den letzten 5 Basen am 3'-Ende des Primers sollten mindestens 2G- oder C-Basen (GC-Klemme) vorhanden sein. Die GC-Klemme fördert eine starke Bindung an die Zielsequenz.
7. Am 5'-Ende des Primers können Restriktionsstellen mit 5-6 Nukleotiden angefügt werden.
8. Die Dinukleotid-Wiederholungen (ATATATAT) oder Wiederholungen des gleichen Nukleotids mehr als 4 Mal (ACCCC) sollten in den Primersequenzen vermieden werden. Dies führt zu Fehlprimern.
9. Intra-Primer-Homologie oder die Sekundärstrukturen von Primern sollten vermieden werden. Homologie zwischen Primern oder komplementäre Sequenzen in den Vorwärts- und Rückwärtsprimern sollten vermieden werden. Beide Bedingungen können Selbstdimere oder Primer-Dimere bilden.
10. Der ΔG-Wert für die Dimeranalyse sollte zwischen 0 bis -9 kcal/mol liegen.

Für die Leichtigkeit des Primer-Designs stehen viele Online-Tools wie Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar usw. zur Verfügung. Die Spezifität der entworfenen Primer kann mit Tools wie NCBI Primer-BLAST oder UCSC in-silico PCR bestimmt werden.

Abbildung 3: Primer-3-Schnittstelle

So entwerfen Sie einen Sequenzierungs-Primer

Sequenzierungsprimer sind kurze DNA-Stränge, genau wie PCR-Primer. PCR-Primer sind jedoch für die Amplifikation eines bestimmten DNA-Fragments ausgelegt, während Sequenzierungsprimer verwendet werden, um die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragments durch PCR aufzudecken. Im Gegensatz zu PCR-Primern kann ein einzelner Primer bei der Sequenzierung verwendet werden, wenn nur die Zielsequenz weniger als 500 bp lang ist. Als Beispiel kann der Vorwärtsprimer der PCR bei der Sequenzierung verwendet werden, um nur den Sense-Strang zu amplifizieren. Darüber hinaus ist der Grad an Mismatches, der während der Sequenzierungsreaktion toleriert wird, höher als bei der PCR. Im Allgemeinen sind PCR-Primer komplementär zur Zielsequenz. Einige Sequenzierungsprimer sind jedoch nicht mit der Zielsequenz verwandt. Sie sind als Universalprimer bekannt. Universelle Primer wie T7 oder SP6 binden an den Vektor, der die Zielsequenz trägt. Sie können sowohl für eine Vielzahl von Vektoren als auch für verschiedene Arten von DNA-Fragmenten verwendet werden.

Abschluss

Primer werden bei der PCR und Sequenzierung zur Initiierung der DNA-Synthese verwendet. Zwei Typen von PCR-Primern können als Vorwärts- und Rückwärtsprimer identifiziert werden. Vorwärtsprimer binden an den Sense-Strang, während Rückwärtsprimer an den Antisense-Strang binden. Bei der Sequenzierung können entweder Vorwärts- oder Rückwärtsprimer verwendet werden, um das Ziel zu amplifizieren. Beim Design von Primern sollten viele Faktoren berücksichtigt werden, wie Primerlänge, Tm und GC-Gehalt. Es stehen viele Online-Tools zur Verfügung, die zum Designen von Primern für eine bestimmte Sequenz verwendet werden können.

Referenz:

1. „Primer-Design: Tipps für einen effizienten Prozess.“ Genome Compiler Corporation, 3. November 2015, hier verfügbar. 2. „Sequenzierung von Primern und Primerdesign.“ Sequenzierungsprimer und Primerdesign, University of Calgary, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Primers RevComp“ von Zephyris – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 2. „Polymerase-Kettenreaktion“ von Enzoklop – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia