Die Oligo-dT/Träger-Kombinationen werden hauptsächlich bei der Reinigung von mRNA aus Gesamt-RNA durch eine als Affinitätschromatographie bekannte Technik verwendet. Es gibt zwei Hauptmethoden, um mRNA aus Gesamt-RNA basierend auf dem Zelltyp zu isolieren; nämlich das direkte Verfahren der mRNA-Isolierung und das Minus-Verfahren der mRNA-Isolierung. Beide Methoden werden in diesem Artikel erklärt.

Messenger-RNA (mRNA) ist ein Transkriptionsprodukt, das aus einer Reihe von RNA-Nukleotiden besteht. Es transportiert Informationen in Genen vom Zellkern zum Zytoplasma für die Synthese von Proteinen. Die RNA-Isolierung aus einer bestimmten Zelllinie führt zu Gesamt-RNA, die zusammen mit mRNAs aus rRNAs und tRNAs besteht. Daher sollte mRNA während der Untersuchung des Transkriptoms der Zelllinie von der Mischung der Gesamt-RNA getrennt werden. Für die Trennung werden einzigartige Eigenschaften der mRNA wie das Vorhandensein eines Poly(A)-Schwanzes am 3'-Ende des mRNA-Moleküls genutzt. Da Oligo-dT-Moleküle zum Poly(A)-Schwanz komplementär sind, kann mRNA aus einem Gemisch von Gesamt-RNA isoliert werden.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist mRNA – Definition, Struktur, Funktion 2. Wie ist die Zusammensetzung der Gesamt-RNA? – mRNA, rRNA, tRNA 3. So isolieren Sie mRNA aus Gesamt-RNA – Verwendung von Oligo-dT/Trägermolekülen

Schlüsselbegriffe: Affinitätschromatographie, Messenger-RNA (mRNA), Minus-Methode, Oligo dT, Poly(A)-Schwanz, Gesamt-RNA

Was ist mRNA

Die mRNA ist ein Transkript eines proteinkodierenden Gens. Es wird in Eukaryoten im Zellkern produziert und trägt Informationen zur Produktion eines bestimmten Proteins in das Zytoplasma. Es wird während der Translation in eine Aminosäuresequenz des Proteins übersetzt, unterstützt von Ribosomen. Das primäre Transkript, das durch die Transkription von Eukaryoten produziert wird, wird als Prä-mRNA bezeichnet.

Abbildung 1: mRNA-Struktur

Während posttranskriptioneller Modifikationen wird ein reifes mRNA-Molekül mit mehreren Merkmalen wie 5'-Kappe und Poly(A)-Schwanz produziert. Die gesamte mRNA eines bestimmten Organismus wird als Transkriptom bezeichnet.

Was ist die Zusammensetzung der Gesamt-RNA?

Das Ergebnis der RNA-Isolierung wird als Gesamt-RNA bezeichnet. Es besteht aus allen drei Haupttypen von RNA, die von einer Zelle produziert werden. Sie sind mRNA, tRNA und rRNA. Sowohl tRNA als auch rRNA helfen bei der Translation. Die Größe der eukaryontischen mRNA beträgt 0,5-20 kb. Transfer-RNA (tRNA) bringt bei der Translation entsprechende Aminosäuren mit. Es ist 76-90 Basenpaare lang und besteht aus einer Anticodon-Region, die zu einem bestimmten Codon auf der mRNA komplementär ist. Ribosomale RNA (rRNA) ist ein Bestandteil von Ribosomen. Einige der menschlichen rRNAs sind 5 kb lang.

Über 90% der gesamten RNA besteht aus tRNA und rRNA. Nur 1-5% der Gesamt-RNA ist mRNA. Eine typische Säugerzelle kann aus ungefähr 500.000 mRNA-Molekülen pro Zelle bestehen. Die Menge eines bestimmten mRNA-Typs kann 15-20.000 Kopien pro Zelle betragen.

So isolieren Sie mRNA aus Gesamt-RNA

Eine Reihe von molekularbiologischen Techniken wie der Aufbau von cDNA-Bibliotheken, Probenvorbereitung für die Mikroarray-Präparation, Northern-Blot-Analyse für schwach exprimierte Gene usw. erfordern hochwertige mRNA. Es gibt zwei Hauptmethoden, um mRNA aus Gesamt-RNA basierend auf dem Zelltyp zu isolieren: die direkte Methode der mRNA-Isolierung und die Minus-Methode der mRNA-Isolierung.

Direkte Methode der mRNA-Isolierung

Das Prinzip der Trennung reifer mRNA von eukaryontischer Gesamt-RNA beinhaltet die Affinitätsselektion/Affinitätschromatographie von polyadenylierter mRNA unter Verwendung von Oligo-dT (Oligodeoxthymidylat), das zum Poly(A)-Schwanz komplementär ist. Möglich wird dies durch das Fehlen eines Poly(A)-Schwanzes in den beiden anderen RNA-Typen: tRNA und rRNA.

mRNA besteht aus 30-200 Adeninnukleotiden in ihrem Poly(A)-Schwanz. Mit Oligo-dT/Träger-Kombination gefüllte Affinitätssäulen werden bei der Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA verwendet. Die Oligo-dT/Träger-Kombination kann entweder Cellulose-gebundenes Oligo-dT, biotinyliertes Oligo-dT mit Streptavidin-gekoppelten magnetischen Kügelchen oder Oligo-dT-gekoppelte Polystyrol-Latex-Kügelchen sein. Alle Versuchsbedingungen sollten RNase-frei sein, um den enzymatischen Abbau von RNA zu verhindern.

Abbildung 2: Affinitätschromatographie

Gesamt-RNA sollte in einem Hochsalzpuffer gelöst und kurz auf 65-70 °C erhitzt werden, um Sekundärstrukturen der RNA aufzubrechen. Die Bedingungen für die Isolierung von RNA variieren zwischen kommerziell erhältlichen Kits für die mRNA-Isolierung. Die Herstellung von poly(A)-RNA oder mRNA besteht jedoch aus drei Schritten.

1. Hybridisierung von poly(A)-RNA an Oligo-dT-Moleküle, die an einen Träger gebunden sind
2. Abwaschen ungebundener RNA
3. Elution von poly(A)-RNA aus Oligo-dT/Träger-Kombination unter Bedingungen niedriger Stringenz

Minus-Methode der mRNA-Isolierung

Oligo-dT-basierte Reinigung von mRNA ergibt nur mRNA mit einem Poly(A)-Schwanz oder reife eukaryotische mRNA. Daher kann ein anderes Verfahren, das als Minus-Verfahren bekannt ist, bei der Reinigung von mRNA verwendet werden, die keinen Poly(A)-Schwanz aufweist. Dieses Verfahren kann bei der Isolierung von mRNA aus Hefe und bakterieller Gesamt-RNA verwendet werden. Es kann auch bei der Isolierung von mRNA vom unreifen Typ zusammen mit der reifen mRNA aus eukaryontischen Zellen verwendet werden. Es beinhaltet die Anreicherung des Transkriptoms durch Abreicherung großer ribosomaler RNA aus der Gesamt-RNA. Das RiboMinus^TM Das Transcriptome Isolation Kit von ThermoFisher Scientific verwendet drei Schritte zur effizienten Reinigung von mRNA aus Hefe und bakterieller Gesamt-RNA.

1. Hybridisierung von Gesamt-RNA mit rRNA-sequenzspezifischen, 5′ Biotin-markierten Oligonukleotidsonden
2. Entfernung des rRNA/5′-Biotin-markierten Sondenkomplexes zusammen mit den Streptavidin-beschichteten magnetischen Beads
3. Reinigung von Verunreinigungen und Elution von mRNA.

Abschluss

Die Gesamt-RNA besteht aus den drei Haupttypen von RNA: mRNA, rRNA und tRNA. Die Aufreinigung von mRNA aus Gesamt-RNA ist für die Analyse des Transkriptoms eines bestimmten Organismus unerlässlich. Die Reinigungsverfahren richten sich nach der Art der mRNA. Eukaryotische mRNA, die einen Poly(A)-Schwanz enthält, kann durch Affinitätschromatographie mit Oligo-dT isoliert werden. Unreife eukaryotische mRNA und mRNA aus Hefe- und Bakterienzellen können durch Abreichern großer rRNA aus Gesamt-RNA isoliert werden.

Referenz:

1. „mRNA-Extraktion“. Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich. 2. „RNA-Extraktion nach RNA-Typ.“ Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Reife mRNA“ (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 2. „Affinität“ von Jamit bei englischen Wikibooks – Von en.wikibooks auf Commons übertragen von Adrignola mit CommonsHelper (Public Domain) über Commons Wikimedia