Stabile Transfektion ist die langfristige Einführung fremder DNA in Zellen. Stabil transfizierte Zellen geben die fremde DNA durch Nachkommen weiter. Deswegen, Um stabil transfizierte Zelllinien herzustellen, muss fremde DNA in das Genom der Zelllinie integriert werden. Eine stabile Vererbung kann jedoch auch in nicht genomischer DNA beobachtet werden. Eine erfolgreiche, stabile Transfektion erfordert effektive Methoden der DNA-Lieferung sowie Selektionsmethoden für fremde DNA innerhalb der Zelllinie. Stabil transfizierte Zelllinien werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet, wie die Herstellung rekombinanter Proteine, Genfunktionsstudien, Assays zur Wirkstoffforschung usw.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Wie man eine stabile transfizierte Zelllinie herstellt – Protokoll zur Erzeugung stabiler Zelllinien 2. So wählen Sie transfizierte DNA in einer Zelllinie aus – Auswahl einer stabil transfizierten Zelllinie

Schlüsselbegriffe: Episomale Aufrechterhaltung, Integration in das Genom, Plasmid, Selektion, stabil transfizierte Zelllinien

Wie man eine stabile transfizierte Zelllinie herstellt

Transfektion ist eine Methode des Gentransfers, bei der das genetische Material gezielt durch chemische oder nicht-chemische Verfahren in die Wirtszelle eingebracht wird. Es gibt zwei Arten von stabil transfizierten Zelllinien:

1. Der Haupttyp stabiler Zelllinien wird durch die direkte Integration von transfizierter DNA in das Genom des Wirtsorganismus erzeugt. Transfizierte DNA wird durch homologe Rekombination in das Genom integriert.
2. Die andere Methode zur Erzeugung stabiler Zelllinien ist die episomale Erhaltung der transfizierten DNA. Bei der Transfektion von DNA, die nicht in das Genom integriert ist, werden eukaryontische Vektoren verwendet. Die Stabilität episomaler DNA ist jedoch gering. Episomen werden auch nur von bestimmten Arten aufrechterhalten. Stabil transfizierte Zelllinien sind in 1 gezeigt.

Abbildung 1: Stabil transfizierte Zelllinien

Verfahren

Die Schritte, die bei der Erzeugung stabiler Zelllinien beteiligt sind, werden unten beschrieben.

1. Generierung einer Abtötungskurve, die die optimale Antibiotikakonzentration für die Selektion bestimmt – Die Zellen werden steigenden Mengen an Antibiotikakonzentrationen ausgesetzt, um die minimale Antibiotikakonzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um alle Zellen über eine Woche abzutöten.
2. Transfektion von Zellen mit gewünschtem Plasmidkonstrukt – Die Transfektionsmethode unterscheidet sich je nach Art der Wirtszellen. Liposomenreagenzien werden bei der Transfektion von adhärenten Zelllinien verwendet. Elektrotransfektion oder virale Verfahren werden verwendet, um Suspensionszelllinien zu transfizieren.
3. Auswählen und Vermehren stabiler polyklonaler Kolonien – Nach 48-72 Stunden Transfektion werden den Kulturen hohe, optimale und niedrige Konzentrationen an selektiven Antibiotika zugesetzt, um die stabil transfizierten Zelllinien zu erhalten.

So wählen Sie transfizierte DNA in Zelllinien aus

Selektionsmarker werden mit der transfizierten DNA koexprimiert, um erfolgreich transfizierte Zellen zu selektieren. Das Markergen könnte sich in demselben Vektor (cis) befinden, der verwendet wurde, um die Wirtszelle zu transfizieren, oder auf einem anderen Vektor (trans). Bei der Selektion kann die Resistenz gegen Antibiotika wie Neomycin, Zeocin, Hygromycin, Puromycin, DHFR etc. herangezogen werden. Darüber hinaus können transfizierte Gene mit GFP markiert werden.

Abschluss

Stabile Zelllinien können hauptsächlich durch die Integration von transfizierter DNA in das Genom hergestellt werden. Darüber hinaus kann die episomale Erhaltung transfizierter DNA auch verwendet werden, um in einigen Wirtsorganismen über einen langen Zeitraum stabile Zelllinien herzustellen. Für die Identifizierung transfizierter DNA in der Zelllinie sollte ein Selektionsverfahren vorhanden sein.

Referenz:

1. „Protokoll der Erzeugung stabiler Zelllinien“. Creative BioMart, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Knockout-Mausproduktion 2“ von Kjaergaard – Eigene Arbeit (CC BY 3.0) über Commons Wikimedia