Die ortsgerichtete Mutagenese (SDM) ist ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung einer Mutation in einer bekannten Sequenz. Sie wird oft mit PCR-basierten Methoden durchgeführt. Typischerweise werden bei der ortsgerichteten Mutagenese eine oder zwei Basen verändert. Primer können mit den gewünschten Mutationen entworfen werden, um kleine Änderungen an der Nukleotidsequenz einzuführen. Primer-Extension und inverse PCR können verwendet werden, um Mutationen im großen Maßstab einzuführen. Dieser Ansatz kann die Aminosäurezusammensetzung eines bestimmten Proteins verändern. Die ortsgerichtete Mutagenese wird verwendet, um die Aktivitätsänderungen von Proteinen zu untersuchen. Es wird auch zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist ortsgerichtete Mutagenese (SDM) – Definition, Rolle, Methode 2. Wie man Primer für die ortsgerichtete Mutagenese entwirft – Ersetzungen, Streichungen, Einfügungen

Schlüsselbegriffe: Deletionen, Insertionen, Mutationen, ortsgerichtete Mutagenese, Substitutionen, traditionelle PCR

Was ist ortsgerichtete Mutagenese?

Ortsgerichtete Mutagenese ist eine molekularbiologische Technik, die verwendet wird, um spezifische Veränderungen an einer Nukleotidsequenz eines Gens einzuführen. Es wird verwendet, um die Aminosäuresequenz eines Proteins zu ändern, Restriktionsstellen einzuführen oder zu entfernen, Transkriptionsbindungsstellen zu zerstören und Fusionsproteine ​​zu erzeugen.

Verfahren

Bei der ortsgerichteten Mutagenese werden die Mutationen unter Verwendung von Primern, bestehend aus der gewünschten Mutation, in die Plasmide eingeführt. Die gesamte Matrize wird durch PCR amplifiziert, wobei die Mutation in die Matrize eingebaut wird. Dann wird die Stammmatrize unter Verwendung eines Enzyms, der methylierungsabhängigen Endonuklease, aus der Probe entfernt. Das PCR-Produkt oder das Nicked-Plasmid-Molekül mit der gewünschten Mutation wird in Bakterien transformiert. Die Plasmide können mit gewünschten Modifikationen aus den Bakterien isoliert werden. Der Prozess der ortsgerichteten Mutagenese ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Ortsgerichtete Mutagenese

Drei Hauptarten von Verfahren werden verwendet, um gewünschte Mutationen bei der ortsgerichteten Mutagenese einzuführen. Sie sind traditionelle PCR, Primer-Extension und inverse PCR. Primer-Extension und inverse PCR können verwendet werden, um groß angelegte Nukleotidänderungen einzuführen.

Traditionelle PCR

Herkömmliche PCR kann verwendet werden, um mit modifizierten Primern eine oder zwei Nukleotidänderungen in die Zielsequenz einzuführen. Die Veränderungen können Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen sein. Die Mutation wird während der PCR in das Amplikon eingebaut. Daher wird die ursprüngliche Sequenz im Primer durch die mutierte Sequenz ersetzt.

Primerverlängerung

Bei der Primer-Extension wird die gewünschte Mutation während einer nested-PCR eingebaut. Hier wird die Zielsequenz von zwei Primern flankiert. Die gewünschte Mutation wird in den internen Primer eingebaut und die Mutation wird in der zweiten PCR-Runde eingeführt. Im Allgemeinen nimmt die Spezifität einer PCR-Reaktion mit der erhöhten Anzahl von fehlgepaarten Nukleotiden in den Primern ab. Bei der Primerverlängerung können jedoch lange interne Primer mit groß angelegten Mutationen verwendet werden, da verschachtelte PCR die Spezifität der PCR-Reaktion erhöhen kann.

Inverse PCR

Inverse PCR ist ein Verfahren zur Amplifikation unbekannter DNA-Fragmente durch das Designen von Primern für eine bekannte DNA-Sequenz. Es kann verwendet werden, um Nukleotide in großem Maßstab zu ersetzen, zu löschen oder einzufügen.

Die Anwendungen der ortsgerichteten Mutagenese werden unten beschrieben.

1. Struktur, Funktion und katalytische Eigenschaften von Proteinen untersuchen
2. Zur Verbesserung der Eigenschaften von Proteinen (Protein Engineering)
3. Um Restriktionsendonukleasen-Stellen einzuführen oder zu entfernen.

So entwerfen Sie Primer für die ortsgerichtete Mutagenese

Ortsgerichtete Mutagenese ist ein Verfahren zur Einführung der gewünschten Mutation mittels eines Primers. Die Mutation kann eine Substitution, Insertion oder Deletion sein. Da die Spezifität der PCR mit zunehmenden fehlgepaarten Nukleotiden im Primer abnimmt, kann die traditionelle PCR nur eine oder zwei Basenpaaränderungen in die Zielsequenz einführen. Andere Methoden wie Primer-Extension und inverse PCR können verwendet werden, um Mutationen im großen Maßstab einzuführen. Das Primerdesign bei der ortsgerichteten Mutagenese ist in 2 gezeigt.

Abbildung 2: Primer für die ortsgerichtete Mutagenese

Auswechslung

Bei Substitutionen sollte einer der beiden Primer die gewünschte Mutation in der Mitte des Primers enthalten. Hier annealt die Stelle, die die Mutation enthält, nicht an die Zielsequenz, da sie eine Verzerrung bildet.

Streichung

Bei Deletionen kann die vom Target zu deletierende Sequenz beim Primerdesign vernachlässigt werden. Da diese Sequenz abseits der flankierten Region von Primern liegt, würde sie während der PCR nicht amplifiziert.

Einfügen

Für Insertionen wird die hinzuzufügende Sequenz während des Primerdesigns an das 5'-Ende eines der Primer verschränkt. Daher kann die eingefügte Sequenz auch an das Amplikon angeheftet bleiben.

Abschluss

Ortsgerichtete Mutagenese ist eine Technik, die verwendet wird, um Mutationen in eine DNA-Sequenz einzuführen. Diese Mutationen können Substitutionen, Insertionen oder Deletionen sein. Mutationen im kleinen Maßstab können in die traditionelle PCR eingeführt werden. Mutationen im großen Maßstab können bei der Primerverlängerung oder inversen PCR eingeführt werden. Die Einführung der Mutation erfolgt durch Einbau der gewünschten Mutation in den Primer.

Referenz:

1. „Methoden für die ortsgerichtete Mutagenese.“ INTEGRIERTE DNA-TECHNOLOGIEN, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Site Directed Mutagenesis“ von Knbusby – Eigene Arbeit (Public Domain) über Commons Wikimedia