Quantitative oder Real-Time-PCR wird als Routineassay zur Überwachung der relativen Veränderungen der Genexpression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verwendet. Das Design von Primern und Sonden während der QPCR ist einer der wichtigsten Faktoren, die die Qualität und den Erfolg des Assays beeinflussen. Für das Design von Primern für QPCR gelten mehrere Richtlinien: Der GC-Gehalt der Primer sollte 35-65% betragen; Schmelztemperatur der Grundierungen sollte zwischen 60-68 °C liegen; man sollte auch Sekundärstrukturen, die Wiederholungen von Gs oder Cs, die länger als 3 Basen sind, und die Bildung von Primer-Dimeren vermeiden.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist QPCR? – Definition, Prozess, Verwendungen 2. So entwerfen Sie Primer für QPCR – Richtlinien für das Primer-Design für QPCR

Schlüsselbegriffe: Fluoreszenzfarbstoffe, GC-Gehalt, Schmelztemperatur, Primer, Quantitative PCR (QPCR)

Was ist QPCR?

QPCR ist eine Art von PCR, die die Quantifizierung des Produkts in Echtzeit ermöglicht. Fluoreszierende Farbstoffe können bei der Quantifizierung von PCR-Produkten verwendet werden, indem sie in jedem Schritt markiert werden. In QPCR-Assays können zwei Methoden der Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Sie sind die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und die fluoreszenzmarkierten Sonden. Fluoreszierende Farbstoffe binden an das PCR-Produkt, während Sonden mit dem PCR-Produkt anlagern, um eine stabile Triplex-DNA zu bilden. Der weit verbreitete Fluoreszenzfarbstoff in QPCCR ist SYBR Green, während die Sonden Taqman sein können. Die Verwendung von Sonden beim Nachweis von PCR-Produkten während der QPCR liefert genauere Ergebnisse und erhöht die Sensitivität des Assays.

Abbildung 1: Mechanismus der QPCR

So entwerfen Sie Primer für QPCR

Das Design von Primern für QPCR ist entscheidend für die Erhöhung der Zuverlässigkeit, Genauigkeit und Sensitivität des Assays. Richtlinien für das Design von QPCR-Primern sind unten beschrieben.

1. PCR-Produkt/Amplikon-Größe – Die Größe des PCR-Produkts sollte 50-210 Basenpaare betragen.
2. Primerlänge – Die Länge der Primer sollte 19-23 Nukleotide betragen.
3. GC-Gehalt – Der GC-Gehalt von Primern sollte 35-65% betragen.
4. Schmelztemperatur (Tm) – Die Schmelztemperatur von Primern sollte 60-68 °C betragen. Die Annealing-Temperatur für den Assay ist 5 °C niedriger als die Tm der Primer.
5. Exon-Exon-Verbindung – Bei der Amplifikation von cDNA durch QPCR sollten die Primer die Exon-Exon-Verbindung umfassen, um die Amplifikation kontaminierender DNA zu vermeiden.
6. Wiederholungen und Durchläufe – Dinukleotid-Wiederholungen (TCTCTCTCTC) und wiederholte Nukleotide (z. B. TAAAAAAAGC) sollten vermieden werden.
7. 3’-Komplementarität – Die komplementären Regionen der 3’-Enden von Vorwärts- und Rückwärtsprimern sollten vermieden werden, um die Bildung von Primer-Dimeren zu verhindern.
8. 3’ Stabilität – G- oder C-Reste sollten am 3’-Ende des Primers enthalten sein, um die Stabilität des Annealings zu erhöhen.
9. GC-Klemme – Eine oder zwei GC-Klemmen am 5'-Ende des Primers erhöhen die Spezifität des Annealings.
10. Spezifität – Die Spezifität der Primer sollte von BLAST. überprüft werden
11. SNPs – Primer sollten keine bekannten SNP-Varianten (Single Nucleotide Polymorphism) enthalten

Beim Primer-Design in QPCR können mehrere Online-Tools verwendet werden, wie Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank und OAT.

Abbildung 2: Bildung von Primer-Dimeren

Primer sollten so gestaltet werden, dass die Bildung von Primer-Dimeren bei der QPCR vermieden wird. Dies ist bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zum Nachweis des PCR-Produkts kritisch, da diese Farbstoffe auch an die Primer-Dimere binden und falsch positive Ergebnisse liefern.

Abschluss

QPCR wird zum Nachweis und zur Quantifizierung von PCR-Produkten verwendet. Das Design von Primern ist bei der QPCR entscheidend, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Daher ist es wichtig, die Richtlinien bei der Entwicklung von Primern für QPCR sorgfältig zu befolgen.

Referenz:

1. „Design und Optimierung von QPCR-Assays.“ LSR | Bio-Rad, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Taqman“ von User: Braindamaged – Eigene Arbeit des ursprünglichen Uploaders (Public Domain) über Commons Wikimedia2. „Primer Dimere Bildung En“ Von Tzachi Bar – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia