Die Transfektionseffizienz kann berechnet werden, indem die Zahl der transfizierten Zellen über die Gesamtzahl der Zellen in einer bestimmten Probe gezählt wird. Die Anzahl der Zellen kann durch zwei Verfahren gezählt werden. Die am häufigsten verwendete Methode ist die Verwendung von leicht zu handhabenden Reportern. Diese Reporter können grünes Fluoreszenzprotein (GFP), Luciferase, Beta-Galactosidase, sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) sein. Die neueste Methode zur Berechnung der Transfektionseffizienz besteht darin, Nukleinsäuren zu markieren, um die Verfolgung ihrer intrazellulären Abgabe zu ermöglichen. Einige andere Ansätze wie Western Blotting, Immunfärbung und funktionelle Assays können ebenfalls verwendet werden, um die Transfektionseffizienz zu berechnen. Da die Transfektionseffizienz von mehreren experimentellen Parametern abhängt, ist die Bestimmung der Transfektionseffizienz der Schlüssel, um den Einfluss verschiedener Faktoren auf die Transfektion zu bestimmen.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Welche Methoden werden verwendet, um die Transfektionseffizienz zu berechnen? – Reportersysteme 2. Berechnung der Transfektionseffizienz – Zellzählung

Schlüsselbegriffe: Durchflusszytometrie, GFP, Nukleinsäuremarkierung, Reportersystem, Transfektionseffizienz

Welche Methoden werden verwendet, um die Transfektionseffizienz zu berechnen?

Zur Berechnung der Transfektionseffizienz werden verschiedene Arten von Verfahren verwendet.

1. Reportersysteme

– Grünes Fluoreszenzprotein (GFP) – GFP kommt natürlicherweise in Quallen vor. Es wird sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse transfizierter Zellen durch gleichzeitige Transfektion des GFP-Gens mit dem interessierenden Gen verwendet. Eine qualitative Analyse kann unter einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden. Eine quantitative Analyse kann durch Durchflusszytometrie durchgeführt werden. Als Reporter können neben GFP auch Red-Fluoreszenz-Protein (RFP) und Yellow-Fluoreszenz-Protein (YFP) verwendet werden. E. coli-Kolonien, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, sind in 1 gezeigt.

Abbildung 1: Fluoreszierende Proteine

2. Nukleinsäure-Markierung – Bei der Transfektion können fluoreszenzmarkierte Plasmide verwendet werden. Dann können sie unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt werden.

3. Western Blotting, Immunfärbung und andere funktionelle Assays

So berechnen Sie die Transfektionseffizienz

Die Zahl der Zellen, die den Reporter aufweisen, und die Zahl der Zellen, die den Reporter nicht aufweisen, können unter einem Mikroskop oder durch Durchflusszytometrie gezählt werden. Der Prozentsatz der Zellen, die den Reporter aufweisen, gibt die Transfektionseffizienz an.

Abbildung 2: Transfektionseffizienz

Abschluss

Die Transfektionseffizienz kann berechnet werden, indem die Anzahl der Zellen, die transfizierte DNA aufweisen, über die Gesamtzahl der Zellen in der Probe bestimmt wird. Die Zellzahl kann unter dem Mikroskop oder mittels Durchflusszytometrie mit einem Reportersystem berechnet werden.

Referenz:

1. „Transfektionseffizienz messen.“ Mirus Bio LLC, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „E. coli, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren“ Von Erin Rod – Eigene Arbeit, (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia