Die Sequenzierung ist der Prozess, der an der Bestimmung einer Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments beteiligt ist. Während der Sequenzierung wird das DNA-Fragment mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden durch PCR terminal markiert. Dieser Prozess verwendet vier Arten von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden, und sie sind Didesoxynukleotide (ddNTPs). ddNTPs fehlt eine 3′-OH-Gruppe, an die die Phosphatgruppe des ankommenden Nukleotids gebunden ist. Wenn ein ddNTP an die wachsende Kette hinzugefügt wird, werden daher keine weiteren Nukleotide am 3'-Ende der Kette hinzugefügt. Das bedeutet, dass die Zugabe eines ddNTP in die wachsende Kette das Kettenwachstum beendet. Da ddNTPs in geringen Konzentrationen dem PCR-Gemisch zugesetzt werden, wird jede wachsende Kette auf unterschiedlichen Niveaus terminiert. Die emittierende Fluoreszenz wird detektiert, um die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments am Ende der PCR zu bestimmen.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist DNA-Sequenzierung? – Definition, Typen 2. Wie funktioniert die DNA-Sequenzierung? – Prozess der DNA-Sequenzierung

Schlüsselbegriffe: Didesoxynukleotide (ddNTPs), Fluoreszenzmarker, Gelelektrophorese, Sequenzierung der nächsten Generation, Nukleotidsequenz, PCR, Sanger-Sequenzierung

Was ist DNA-Sequenzierung?

DNA-Sequenzierung ist eine Labortechnik, die bei der Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Moleküls verwendet wird. Es verwendet fluoreszenzmarkierte Nukleotide, die während der PCR eingebaut werden. Es gibt zwei Hauptsequenzierungsmethoden, die auf den Techniken zum Nachweis von Fluoreszenz basieren: Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung.

Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung, 1975 von Fredric Sanger entwickelt, ist die erste entwickelte Sequenzierungsmethode. Es ist auch bekannt als Kettenabbruchmethode seit es ist am selektiven Einbau von kettenabbrechenden ddNTPs während der in vitro-DNA-Synthese beteiligt. Bei der Sanger-Sequenzierung werden Amplikons durch Gelelektrophorese getrennt. Die Sanger-Sequenzierung wird häufig zur Bestimmung der Sequenz der bei der Klonierung verwendeten DNA-Fragmente und der durch PCR amplifizierten Fragmente verwendet. Eine bestimmte DNA-Sequenz ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: DNA-Sequenzierung

Sequenzierung der nächsten Generation

Die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien werden zusammenfassend als Sequenzierung der nächsten Generation bezeichnet. Es ist auch eine Kettenabbruchmethode. Die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet Kapillarelektrophorese zur Trennung von Amplikons mit verschiedenen Längen, die durch die Kettenabbruchmethode erzeugt wurden. Die Next-Generation-Sequenzierung wird bei der Bestimmung einer großen Anzahl von Nukleotiden pro Lauf verwendet, wie beispielsweise bei der Genomsequenzierung.

Wie funktioniert die DNA-Sequenzierung

Bei der DNA-Sequenzierung werden einem bestimmten DNA-Fragment durch PCR fluoreszenzmarkierte Nukleotide hinzugefügt. Zur Verlängerung des DNA-Strangs werden reguläre Desoxynukleotide (dNTPs) verwendet. Allerdings werden dem fluoreszenzmarkierten Reaktionsgemisch ddNTPs zugesetzt. Da ddNTPs keine 3′-OH-Gruppe im Desoxyribose-Zuckermolekül aufweisen, kann ein weiteres Kettenwachstum unterbleiben, wodurch das Kettenwachstum beendet wird. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA wird durch die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen der 3'-OH-Gruppe des Desoxyribose-Zuckers und der Phosphatgruppe des ankommenden Nukleotids gebildet. ddNTPs werden jedoch in geringen Konzentrationen zugesetzt; daher beenden sie das Kettenwachstum nicht sofort.

Vier Arten von ddNTPs werden zu vier separaten PCR-Ansätzen hinzugefügt. Durch Zugabe von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP werden vier separate PCR-Reaktionen durchgeführt. Daher wird in jedem Reaktionsgemisch das Kettenwachstum bei A-, G-, C- bzw. T-Nukleotiden beendet. Als Beispiel wird in der Reaktionsmischung mit zugesetztem ddATP das Wachstum verschiedener Amplikons an jedem A-Nukleotid im DNA-Fragment beendet. Die Bestimmung der DNA-Sequenz durch Sanger-Sequenzierung ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Sanger-Sequenzierung

Jeder der vier Nukleotidtypen wird durch eine separate Fluoreszenzfarbe markiert; das ddATP ist mit grünem Farbstoff markiert; das ddGTP ist mit gelbem Farbstoff markiert; das ddCTP ist blau markiert; das ddTTP ist mit rotem Farbstoff markiert. Daher sind die Amplikons der vier PCR-Reaktionen in separaten Farben gekennzeichnet.

Nach der Amplifikation des interessierenden DNA-Fragments werden die Amplikons entweder durch Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese getrennt. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments kann durch den Nachweis der emittierenden Fluoreszenz bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz von 750-1.000 Basenpaaren langen Fragmenten kann leicht pro Lauf durch Sanger-Sequenzierung bestimmt werden. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines ganzen Genoms bleibt jedoch aufgrund einer großen Anzahl von Nukleotiden in Genomen anfechtbar. Mit Sequenzierungstechniken der nächsten Generation wie der 454-Sequenzierung können jedoch etwa 20 Millionen Basenpaare pro Einzellauf gelesen werden.

Abschluss

DNA-Sequenzierung ist eine molekularbiologische Technik, die bei der Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA-Fragmenten verwendet wird. Bei der Sequenzierung werden den DNA-Fragmenten mittels PCR fluoreszenzmarkierte Nukleotide hinzugefügt. Durch den Nachweis der emittierenden Fluoreszenz kann die Nukleotidsequenz bestimmt werden.

Referenz:

1. „DNA-Sequenzierung“. Khan-Akademie, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „DNA-Sequenz“ von Sjef – Eigene Arbeit, Public Domain) über Commons Wikimedia 2. „Didesoxy-Methode“ von Christoph Goemans (modifiziert) – Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia