DNA-Sequenzierung ist eine Technik, die hilft, die Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Moleküls zu bestimmen. Die beiden Methoden der Sequenzierung sind die Sanger-Sequenzierung und die Next-Generation-Sequenzierung. Beide Arten von Sequenzierungsverfahren sind bis heute vollautomatisiert. Jeder DNA-Strang besteht aus den vier Nukleotiden: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die Nukleotide im DNA-Fragment werden bei beiden Arten von Sequenzierungsverfahren mit vier separaten Fluoreszenzmarkern markiert. Die fluoreszierenden Marker oder Fluorophore sind Moleküle, die Licht absorbieren und mit einer wohldefinierten Wellenlänge emittieren können. Die Fluoreszenzmarker werden durch PCR in den DNA-Strang eingebaut. Dann wird die Sequenz der Nukleotide durch automatisierte Techniken bestimmt.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist Sequenzierung? – Definition, Sanger-Sequenzierung, Sequenzierung der nächsten Generation 2. Wie helfen fluoreszierende Marker, eine Nukleotidsequenz zu bestimmen? – Sequenzierungsverfahren

Schlüsselbegriffe: Didesoxynukleotide (ddNTPs), Fluoreszenzmarker, Gelelektrophorese, Sequenzierung der nächsten Generation, Nukleotidsequenz, PCR, Sanger-Sequenzierung

Was ist Sequenzierung?

Die Sequenzierung ist eine Labortechnik, die verwendet wird, um die Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls zu bestimmen. Zwei Haupttypen von DNA-Sequenzierungsverfahren können als Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung identifiziert werden. Sowohl die Sanger-Sequenzierung als auch die Next-Generation-Sequenzierung verwenden markierte Nukleotide mit Fluoreszenz zur Bestimmung der Nukleotidsequenz.

Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung ist die erste entwickelte Methode zur DNA-Sequenzierung. Die Methode der Sequenzierung wurde erstmals 1975 von Fredric Sanger entwickelt. Daher wird sie als Sanger-Sequenzierung bezeichnet. Die Methode der Sanger-Sequenzierung ist auch bekannt als Kettenabbruchmethode da es am selektiven Einbau von kettenabbrechenden Didesoxynukleotiden (ddNTPS) durch DNA-Polymerase während der in vitro-DNA-Synthese beteiligt ist. Die Verlängerung des DNA-Strangs wird durch die regulären Desoxynukleotide (dNTPs) erreicht. Allerdings werden dem Reaktionsgemisch ddNTPs zugesetzt, um das Kettenwachstum zu beenden. Diese ddNTPs sind fluoreszenzmarkiert. Die vier Arten von ddNTPs werden zu vier separaten PCR-Ansätzen hinzugefügt. Daher werden vier separate PCR-Reaktionen durch Zugabe von ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP durchgeführt. In jedem Reaktionsgemisch wird das Kettenwachstum an jedem A-, G-, C- bzw. T-Nukleotid beendet. Als Beispiel wird in der Reaktionsmischung mit zugesetztem ddATP das Wachstum verschiedener Amplikons an jedem A-Nukleotid im DNA-Fragment beendet. Dann werden diese vier Reaktionen durch Gelelektrophorese getrennt, und ein Fluorometer wird verwendet, um nach der getrennten Fluoreszenz zu scannen. Die Sanger-Sequenzierung wird häufig zur Bestimmung der Sequenz der bei der DNA-Klonierung verwendeten Fragmente und der durch PCR amplifizierten Fragmente verwendet. Die ermittelten Nukleotidsequenzen sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: DNA-Sequenzen

Sequenzierung der nächsten Generation

Die neuesten DNA-Sequenzierungstechnologien werden zusammenfassend als Sequenzierung der nächsten Generation bezeichnet. Die Sequenzierungsreaktionen werden im Mikromaßstab auf einem Chip gleichzeitig durchgeführt. Daher werden mehrere Sequenzierungsreaktionen parallel durchgeführt. Bei der Next-Generation-Sequenzierung wird die Kapillarelektrophorese zusätzlich zur Gelelektrophorese zur Trennung von Amlicons unterschiedlicher Länge verwendet, die durch das Kettenabbruchverfahren erzeugt wurden. Die Kapillarelektrophorese ist ein analytisches Trennverfahren, bei dem Moleküle aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt werden.

Wie helfen fluoreszierende Hersteller, eine Nukleotidsequenz zu bestimmen?

Bei der Sequenzierung dient die zu sequenzierende DNA als Template-Strang für die DNA-Synthese mittels PCR. Ein DNA-Primer wird zur Initiierung der DNA-Synthese durch DNA-Polymerase verwendet. Als Komponenten der PCR-Reaktion werden eine Mischung aus regulären vier Basen (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und einer geringen Menge eines der vier Didesoxynukleotide (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP) zugegeben. Somit werden vier individuelle PCR-Reaktionen durch die Zugabe von jedem der vier ddNTPs durchgeführt. Didesoxynukleotide besitzen zwei besondere Eigenschaften:

1. Ihnen fehlt die 3'-OH-Gruppe, an die das ankommende Nukleotid durch DNA-Polymerase angefügt wird. Daher beendet der Einbau des ddNTP das Kettenwachstum.
2. Sie sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert: die ddATP ist mit einem grünen Farbstoff markiert, das ddGTP ist mit einem gelben Farbstoff markiert, das ddCTP ist blau gekennzeichnet, und der ddTTP ist mit rotem Farbstoff markiert.

Die kettenabbrechenden ddNTPs werden jedoch in geringen Konzentrationen zugegeben; sie beenden nicht den gesamten PCR-Prozess auf einmal. Wenn jedoch eines der vier ddNTPs in die wachsende Kette eingebaut wird, wird dieses spezielle Kettenwachstum beendet. Deswegen, am Ende von jeweils vier PCR-Reaktionen wird eine Reihe von Amplikons (die durch PCR resultierenden DNA-Fragmente) produziert, die an jedem Nukleotid des Ziel-DNA-Fragments terminiert sind. Diese Amplikons können in einem Gel laufen gelassen werden. Die an einer definierten Stelle des Elektrophoresegels passierenden Fluoreszenzfarbstoffe können mit einem Fluorometer gescannt werden, um die Nukleotidsequenz in den automatisierten DNA-Sequenzern zu bestimmen. Die bei der DNA-Sequenzierung erhaltene fluoreszenzmarkierte Nukleotidsequenz ist in 2 gezeigt.

Abbildung 2: Fluoreszenz-markierte Nukleotidsequenz

Durch Kombinieren jedes der Nukleotide in der Reihe kann die Nukleotidsequenz des anfänglichen DNA-Fragments bestimmt werden. Die Nukleotidsequenz eines Fragments mit 750-1.000 Basenpaaren kann durch Sanger-Sequenzierung leicht pro Lauf bestimmt werden. Die Sequenzierung eines ganzen Genoms bleibt jedoch aufgrund des Vorhandenseins einer großen Anzahl von Nukleotiden weiterhin problematisch. 454-Sequenzierung ist eine Art der Sequenzierung der nächsten Generation, bei der 20 Millionen Basenpaare pro Einzellauf gelesen werden können.

Abschluss

Die Sequenzierung ist eine Technik, die bei der Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten DNA-Fragments verwendet wird. Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung sind die beiden wichtigsten Sequenzierungstechnologien. Beide Technologien verwenden Fluoreszenzmarker zur Bestimmung der Nukleotidsequenz. Jedes der vier kettenabbrechenden Didesoxynukleotide ist mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und sie werden in vier separaten PCR-Reaktionen verwendet, um die Sequenz zu erhalten.

Referenz:

1. Adams, Jill U. „DNA-Sequenzierungstechnologien“. Nature News, Nature Publishing Group, hier verfügbar. 2. Carr, Steven M. Fluoreszenz-Sequenzierung, hier erhältlich. 3. „DNA-Sequenzierung – Automatisierte Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen.“ JRank-Artikel, hier verfügbar.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Alineando secuencias (2)“ von Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) über Flickr 2. „Radioactive Fluorescent Seq“ von Abizar in der englischen Wikipedia (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia