Southern Blotting ist eine Technik, die zum Nachweis spezifischer DNA-Fragmente in einer Probe verwendet wird. Die Blotting-Technik beinhaltet die Trennung von DNA-Fragmenten basierend auf der Größe mittels Gelelektrophorese, das Übertragen der größenfraktionierten DNA-Probe auf eine Filtermembran, das Hybridisieren der spezifischen DNA-Fragmente mit einer markierten, sequenzspezifischen Sonde und das Detektieren der markierten Banden.

Neben der Identifizierung spezifischer DNA in einer Probe können auch die Größe und die Häufigkeit eines bestimmten DNA-Typs durch Southern-Blotting bestimmt werden. Der beim Southern-Blotting beteiligte Prozess wird in diesem Artikel beschrieben.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist Southern Blotting? – Definition, Prinzip, Anwendungen 2. Wie funktioniert Southern Blotting? – Verfahren des Southern Blotting

Schlüsselbegriffe: DNA, Gelelektrophorese, Hybridisierungssonde, Nylonmembran, Restriktionsverdau, Southern Blotting

Was ist Southern Blotting?

Southern Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die bei der Identifizierung spezifischer DNA in einer Probe verwendet wird. Die Technik wurde erstmals 1975 von Edward M. Southern entwickelt. Dieser Prozess identifiziert DNA-Sequenzen, Größe und Häufigkeit einer bestimmten DNA-Sequenz in einer Probe.

Eine Southern-Blotting-Membran ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Southern Blotting Membran

Anwendungen des Southern Blotting

Anwendungen des Southern-Blottings werden unten beschrieben.

1. Um ein bestimmtes DNA-Fragment zu erkennen
2. Um ein bestimmtes DNA-Fragment zu isolieren
3. Um Mutationen und Genumlagerungen zu identifizieren
4. In RFLP-Assays (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)
5. Um genetische Krankheiten zu erkennen
6. Um Infektionserreger zu identifizieren
7. Vaterschaftstest
8. Beim DNA-Fingerabdruck zur Identifizierung von Kriminellen

Wie funktioniert Southern Blotting

Beim Southern-Blotting werden DNA-Fragmente anhand der Größe mittels Gelelektrophorese getrennt, in eine Membran überführt, mit einer markierten, sequenzspezifischen Sonde hybridisiert und die markierten Banden nachgewiesen. Die Schritte des Southern-Blottings werden unten beschrieben.

1. DNA-Verdau – DNA-Probe wird durch Restriktionsenzyme verdaut, um DNA-Fragmente zu erhalten, und diese Fragmente werden durch PCR amplifiziert.
2. Gelelektrophorese – DNA-Fragmente werden durch Gelelektrophorese größenfraktioniert.
3. Denaturierung – Das Gel mit fraktionierter DNA wird in NaOH oder HCl getränkt, um doppelsträngige DNA zu denaturieren.
4. Blotting – DNA-Fragmente im Gel werden durch ein Verfahren namens Blotting in eine positiv geladene Nylonmembran übertragen.
5. Backen und blockieren – Das Blotting-Papier mit DNA-Fragmenten wird gebacken, um die DNA auf der Membran zu fixieren. Dann werden die unbesetzten Bindungsstellen durch Behandlung mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein gesättigt.
6. Hybridisierung mit markierten Sonden – DNA-gebundene Membran wird mit einer markierten Sonde behandelt, die eine komplementäre Nukleotidsequenz zum interessierenden DNA-Fragment enthält. Hybridisierungssonden sind im Allgemeinen 100–500 bp lang und mit radioaktiven Nukleotiden markiert.
7. Visualisierung durch Autoradiogramm – Die sondengebundene Membran wird unter Autoradiogramm sichtbar gemacht, um die Muster des interessierenden DNA-Fragments zu erhalten.

Abbildung 2: Southern Blotting

Der gesamte Prozess des Southern-Blottings ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abschluss

Southern Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die bei der Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen aus einer Probe verwendet wird. Dabei wird die DNA-Probe durch Restriktionsenzyme fraktioniert und die Mischung auf einem Gel laufen gelassen. Anschließend wird das Bandenmuster im Gel auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer markierten Sonde hybridisiert, was den Nachweis des interessierenden Fragments ermöglicht.

Referenz:

1. „Southern Blotting“. Thermo Fisher Scientific, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Southern Blot Membran“ Von Bojan Žunar – Eigene Arbeit (CC BY-SA 4.0) über Commons Wikimedia2. „Abbildung 17 01 05“ von CNX OpenStax – (CC BY 4.0) über Commons Wikimedia