Western Blotting ist eine Technik in der Molekularbiologie, die zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Probe verwendet wird. Es verwendet SDS-PAGE, um Proteine ​​basierend auf ihrer Größe zu trennen, und diese getrennten Proteine ​​werden dann in eine Membran übertragen. Diese Technik verwendet spezifische Primärantikörper bei der Markierung eines bestimmten Proteins im Blot. Mit Reporterproteinen markierte Sekundärantikörper erkennen die markierten Proteine ​​mit dem Primärantikörper.

Abgedeckte Schlüsselbereiche

1. Was ist Western Blotting? – Definition, Fakten, Anwendungen 2. Wie funktioniert Western Blotting? – Verfahren des Western Blotting

Schlüsselbegriffe: Farbentwicklung, Nitrozellulosemembran, Primärantikörper, Sekundärantikörper, Western Blotting

Was ist Western Blotting?

Western Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die beim Nachweis eines bestimmten Proteins in einer Probe verwendet wird. Es wird auch Immunblotting genannt, da die Technik Antikörper sowohl zum Markieren des interessierenden Proteins als auch zum Nachweis der Antikörper-markierten Proteine ​​verwendet.

Abbildung 1: Western Blot

Western Blotting wurde erstmals 1979 von Towbin entwickelt und wird derzeit als Routinetechnik der Proteinanalyse verwendet.

Wie funktioniert Western Blotting

Western Blotting wird hauptsächlich zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Probe verwendet. Die Schritte der Western-Blotting-Technik werden unten beschrieben.

1. SDB-SEITE – Die Proteinprobe wird nach ihrer Größe durch SDS-PAGE getrennt.
2. Übertragung von Proteinen auf eine Membran – Die größenfraktionierten Proteine ​​werden entweder in eine Nitrozellulose- oder Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran überführt. Die an dieser Übertragung beteiligte Technik ist die Diffusionsübertragung.
3. Blockieren unspezifischer Websites – Die unbesetzten Stellen auf der Membran werden blockiert, um die unspezifische Bindung von Proteinen zu verhindern. Zu diesem Zweck kann fettarme Trockenmilch oder Rinderserumalbumin (BSA) verwendet werden.
4. Primärantikörper-Inkubation – Die blockierte Membran wird mit einer primären Antikörperlösung inkubiert. Diese primären Antikörper binden an ein bestimmtes Protein auf der Membran.
5. Sekundärantikörper-Inkubation – Die Membran wird mit Sekundärantikörpern inkubiert, die an die Primärantikörper binden. Sekundäre Antikörper werden an Reporterproteine ​​konjugiert. Diese Reporterproteine ​​können Biotin, alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase sein.
6. Proteinerkennung durch Farbentwicklung – Die konjugierten Enzymreporter reagieren mit ihrem Substrat, um eine farbige alkalische Phosphatase zu erzeugen, die BCIP in ein blaues Produkt umwandelt, während Meerrettichperoxidase Luminol umwandelt und Lumineszenz emittiert.

Abbildung 2: Western Blotting – Vorgehensweise

Abschluss

Western Blotting ist eine Hybridisierungstechnik, die zum Nachweis der Anwesenheit eines bestimmten Proteins in einer Probe verwendet wird. Es verwendet SDS-PAGE, um Proteine ​​basierend auf ihrer Größe und Bindung mit primären Antikörpern zu trennen, die während der Farbentwicklung von sekundären Antikörpern erkannt werden können.

Referenz:

1. „Western Blotting-Grundprinzip, wie Western Blots funktionieren.“ Booster, hier erhältlich.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. „Anti-Liponsäure-Immunoblot“ von TimVickers – Eigene Arbeit (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia 2. „Western Blotting“ von Cawang – Eigene Arbeit, CC0) über Commons Wikimedia